2026-09-26
华盛顿大学 Baker 实验室用 RFD2-MI 从头设计半胱氨酸蛋白酶：69 个设计里 13 个能按序列剪切肽键，最优变体 Dokki-v2 的 kcat 达 0.064 s⁻¹，比未催化反应快 18 亿倍，并在哺乳动物细胞里工作。
酰胺键把氨基酸串成蛋白质。中性水溶液里，这条键的半衰期以百年计，水解能垒极高。自然界靠蛋白酶干这件事：半胱氨酸蛋白酶用 Cys-His-Asp 催化三联体把半胱氨酸激活成亲核试剂，再用氧阴离子穴稳住多步反应里的高能中间体。一条肽结合槽把待切酰胺键按到半胱氨酸旁边。
计算设计酶已经能对付一些低能垒模型反应，最近也做出了切活化酯的丝氨酸水解酶。蛋白质骨架上的酰胺远比酯稳定，极性底物也更难结合。活性位点必须同时满足催化几何和肽段定位，这件事卡了几十年。华盛顿大学蛋白设计研究所这次用生成式模型，从零搭出全新折叠的半胱氨酸蛋白酶。
催化几何取自酵母 SUMO 蛋白酶 Ulp1（PDB 1EUV）：Cys580、His514、Asp531 组成三联体，Gln574 加上 578–579 的骨架氮构成氧阴离子穴，再带上底物骨架四个残基。设计时不锁定切割序列，让底物构象和序列跟酶一起被采样。
骨架由 RFD2-MI 生成。这是 RFdiffusion2 面向酶和蛋白-蛋白界面的版本，可以从完全噪声出发，只靠活性位点原子坐标约束扩散轨迹，不必预先指定催化残基在序列上的位置。半胱氨酸比丝氨酸更容易被激活，所以选它当亲核试剂。β 链配对用来把极性肽骨架放进结合槽，并补偿去溶剂化代价。
管线分三轮。五万条初始骨架经 DSSP 过滤后剩下 3232 条。ProteinMPNN 配序列时把催化残基锁死，原子间距用 0.1 Å 容差约束，再经 AlphaFold 3 做 apo 态自洽过滤。随后两轮部分扩散（T=40 和 T=10）收紧几何。最终留下的设计，AF3 对 apo 和复合物的预测都要贴近设计模型：复合物 pLDDT 大于 90，apo 与复合物 Cα RMSD 小于 0.8 Å，催化几何还要对得上。
筛活用了顺式融合：酶的 C 端接上对应底物，后面再接红色荧光蛋白 mScarlet 和 His 标签。酶如果真能切，大肠杆菌表达过程中就会把 mScarlet 放出来，镍柱纯化后 SDS-PAGE 和体积排阻色谱一眼能分开全长和切开产物。
69 个设计里 13 个有剪切活性，成功率 19%，对应 12 条独特骨架里的 3 条。三个家族分别叫 Gawi、Kal、Dokki。Dokki 和 Kal 能把底物切干净，Gawi 约 95%。LC-MS 确认 13 个活性设计都切在预定位点。Cys 或 His 突变成 Ala，活性消失；氧阴离子穴的 Gln/Asn 突变并不一律灭活，论文推测有序水分子可能补上氢键。
拿到合成的 8 肽 FRET 底物做反式反应，Gawi 家族活性太低，Kal 家族底物溶解度差，只有 Dokki 家族能测动力学。原始设计的估计 kcat 大约是 Gawi 10⁻⁶ s⁻¹、Dokki 10⁻⁴ s⁻¹。用 ProteinMPNN 再设计，Gawi 21 个变体里 7 个加快，Dokki 89 个里 24 个加快，幅度 1.2 到 31 倍。稳态动力学：Gawi-09 的 kcat 为 （0.8±0.1）×10⁻⁵ s⁻¹，KM 34±4 μM，kcat/KM 0.24±0.03 M⁻¹ s⁻¹；Dokki-15 的 kcat 为（1.1±0.1）×10⁻³ s⁻¹，KM 89±10 μM，kcat/KM 12±2 M⁻¹ s⁻¹。Dokki-15 的 pH-速率曲线呈钟形，最适约 pH 7.0（表观 pKa 6.0 和 8.0）。圆二色谱给出 Tm 超过 80 °C，约 70 °C 仍有活性。对 cognate 序列 VPTLTGG/G 高度特异，七条序列相近的肽几乎不切。
对 Dokki-15 活性位点附近 20 个位置做了 185 个单点突变，多数变差，说明 MPNN 原序列已经接近局部最优。Tyr41、Ser44、Pro67、Thr99 四处出现增益突变，当初 ProteinMPNN 给它们的概率都很低。四突变组合 Dokki-v2（Y41T:S44V:P67V:T99F）的 kcat 为 0.064±0.005 s⁻¹，KM 154±14 μM，kcat/KM 413±50 M⁻¹ s⁻¹，每个活性位点超过 130 次周转。相对 Dokki-15，提升几乎全来自 kcat 的 58 倍。未催化肽键水解的 kuncat 是 3.6×10⁻¹¹ s⁻¹，Dokki-v2 加速 1.8×10⁹ 倍。
| 酶 | kcat (s⁻¹) | kcat/KM (M⁻¹ s⁻¹) |
| Gawi-09 | 8×10⁻⁶ | 0.24 |
| Dokki-15 | 1.1×10⁻³ | 12 |
| Dokki-v2 | 0.064 | 413 |
| TEV（文献） | 0.16 | 2620 |
| Ulp1 切 SUMO | 6.1 | 同等短肽上未报告 |
Dokki-v2 的 kcat 比常用的 TEV 低约 2.5 倍，催化效率低约 6 倍，落在序列特异天然半胱氨酸蛋白酶的下沿。Ulp1 切带 SUMO 结构域的底物时 kcat 约 6.1 s⁻¹，切不含 SUMO 的短肽时测不到活性。
六套晶体结构覆盖三个骨架，分辨率从 1.77 Å 到 3.38 Å，与设计模型的 Cα RMSD 都小于 1.2 Å。Foldseek 对着 PDB 和 AlphaFold 库搜，TM-score 全部低于 0.50，Gawi-09 最低 0.46，折叠不在已知天然蛋白酶里。HeLa 细胞里，Dokki 系列（包括计算机里直接出来、没做过湿实验优化的原始设计）能把核内 H2B-sfGFP-底物-mScarlet 报告蛋白切开，红色信号从核内散开；Cys-to-Ala 突变体两个荧光蛋白仍共定位在核内。
生成式设计第一次认真啃酰胺水解这种高能垒反应，而且做出的酶折叠是新的。对做蛋白设计的人，这条管线可以直接复用到别的序列特异蛋白酶：RFD2-MI 搭骨架，MPNN 配序列，AF3 过滤，融合报告筛活。对做合成生物学的人，按目标序列在计算机里出蛋白酶、在哺乳动物细胞里切开报告蛋白，这条路已经通了。可编程蛋白回路不必再绑死在 TEV、HRV3C 那几把天然刀上。
这仍是突破和渐进叠在一起。突破是「从头、新折叠、真切酰胺键、细胞里能用」。渐进是催化效率还在天然酶下沿：Dokki-v2 离 TEV 只有数倍，离 Ulp1 切 SUMO 还有约两个数量级。
论文把剩余差距归因于两件事：活性位点预组织不够紧，底物定位不够准。PLACER 系综里，Dokki 的 His45 会采到被 Ser44 稳住的非生产构象；Dokki-v2 的 Y41T 和 S44V 压掉这种状态。氧阴离子 Gln 距离仍比 Ulp1 长，TS1 生产构象占比 36%，Ulp1 是 100%，这也解释了 Gln 敲除只让活性掉 1.9 到 3.8 倍。分子动力学显示，短而偏极性的肽底物结合界面比天然酶小，切键羰基相对催化半胱氨酸的朝向更散。Kal 家族因为底物溶解度，根本没做成可靠动力学。若干优化变体出现底物抑制。
四个真正把 kcat 拉上来的突变，ProteinMPNN 当初都判成低概率。固定骨架的序列设计漏掉了它们，当前管线在催化预组织上的目标函数还不对。晶体结构里 apo 态 Dokki 的催化半胱氨酸被氧化成磺酸，His 所在发夹位移 1.3 Å，设计态和功能态之间还有一层氧化还原的麻烦。治疗用途和「针对内源疾病底物」只写在讨论段，这篇没有疾病模型数据。这是 bioRxiv 预印本，尚未经过同行评审。