2026-08-27
Weissman与Mann组从5.3万病毒小ORF漏斗筛出超2000个活性微蛋白，用Perturb-seq、质谱和AlphaFold 3解析功能，并钉死EBV BNLF2b靠模仿宿主PKA抑制剂促上皮增殖。
病毒基因组又密又乱：重叠读框、非ATG起始、程序性移码，标准注释管线经常漏掉编码序列。核糖体图谱已经在疱疹病毒、流感、SARS-CoV-2、HIV上扫出成千上万个非经典开放读框（ncORF），但绝大多数不知道能不能变成有功能的微蛋白（microprotein，通常短于120个氨基酸）。
HIV的15个注释基因里有7个编码微蛋白，SARS-CoV-2的29个蛋白里有10个是微蛋白。Vpu、Vpr这类短蛋白曾经带出tetherin、DCAF1这类宿主限制因子。整个人类感染病毒组里，这种短蛋白到底有多少、各干什么，一直没有一张功能图。Weissman、Mann、Elledge这几组用表型优先的漏斗，把这件事做成一张泛病毒图谱。
从VirusHostDB里502条人类感染病毒基因组（38科、七类Baltimore分类）抽出全部带起始和终止密码子的小ORF。当时寡核苷酸合成上限是400 nt，所以只收短于121个氨基酸的序列。最终库52979条：注释序列1606条、未注释（不少于24 aa，ATG或CTG起始）47525条（占89.7%）、阴性对照3848条。注释条目里74%的UniProt标注分只有3分及以下，基本只知道序列本身。
过表达有毒ORF会在慢病毒包装阶段就掉库。他们做了pANDORA：Tet-On诱导、反义构型，基础漏表达极低。代价是滴度大约掉50倍，换来SARS-CoV-2 Nsp1这类毒蛋白能活着走到诱导后测量。
漏斗三层。第一层在K562和RPE-1做10天生长筛选，效应量至少偏离阴性对照两个标准差，拿到4329个初级命中（占库的8.2%）。第二层重合成4107条富集库（两边都毒、任一边促生长、全部注释基因），再筛一轮，FDR<0.05得到2028个命中。第三层补MHC-I表面表达、内质网应激存活、针对富集库的Perturb-seq、亲和富集质谱（AE-MS，约2304次运行），再用AlphaFold 3对高置信复合物（界面置信度ipTM>0.75）做结构提名，最后阵列验证。
Perturb-seq用10x Flex探针方案，在RPE-1上给3412条小ORF打转录表型。功能注释走连坐：转录距离加最小畸变嵌入聚类，再叠序列同源和文献。18个已知转录因子阳性对照全部通过能量距离检验且差异基因超过10个，阴性对照差异基因都少于5个。
生长筛选的毒命中在两株细胞上相关（Pearson R=0.78），促生长几乎只在非转化的RPE-1出现。二次命中里70%仍未注释，55%与注释基因重叠，34%用非ATG起始。注释小ORF里58%（939/1606）根本没有生长表型，所以后面补了MHC-I和内质网应激。
| 读出 | 规模 | 命中 |
| 初级生长筛 | 52979 | 4329（8.2%） |
| 富集库生长筛 | 4107 | 2028（FDR<0.05） |
| MHC-I表面 | 8806 | 748 |
| 内质网应激存活 | 富集库 | 602 |
| Perturb-seq能量检验 | 3412 | 1185（其中691条差异基因>10） |
MHC-I命中有40%不进生长筛。已知TAP抑制剂HSV ICP47、EBV BNLF2a、牛痘CPXV012都回来了。抽5个只打MHC-I的候选做质谱，它们分别卡在合成（AKMV OPG024结合STAT1，AF3给出ipTM=0.78）、肽转运、内质网成熟、转运和降解，并没有挤在同一个宿主节点上。许多命中是两段式：跨膜螺旋负责定位，另一段短结构域或短线性基序负责干活。
Perturb-seq划出24个簇（433条）和752个孤点。簇里三种故事同时出现：同源同功能、非同源收敛、同源却分道。HPV E7和腺病毒E4 ORF6/7没有序列同源，却都绑Rb–E2F、把细胞赶进S期。另一簇把HIV Vpr、SARS-CoV-2 ORF6、猴痘MPXVgp154、YLDV132R和一个未注释的HMO星状病毒小ORF拉到一起：都压IFN-α/γ报告，机制是搅核质转运。AF3在ORF6、MPXVgp154、YLDV132R的C端看到接触Rae1货物口袋的残基，多序列比对抽出共享的DDXXMEID类短线性基序；把关键甲硫氨酸突成丙氨酸（ORF6 M58A、MPXVgp154 M69A、YLDV132R M75A）后，IFN抑制表型丢掉。Vpr对Rae1的预测很差（ipTM<0.4），它走的是importin这条线。
那个星状病毒小ORF套印在衣壳基因ORF2的+1框里，起始密码子距ORF2只有19 bp，近缘毒株没有这个起始，像是从头诞生。同一位点在别的星状病毒支上又长出序列和功能都不同的小ORF。
最硬的机制故事是EBV BNLF2b。它在RPE-1和正常口腔角质细胞里促增殖，还能在软琼脂上做锚定非依赖生长，E7能、其他促生长候选不能。质谱把PKA催化亚基PRKACA/PRKACB推到最前；它抑制PKA，宿主抑制剂PKIA过表达能复现生长优势。下游是MAPK：pERK和pMEK升高，RAS抑制剂RMC-7977或MEK抑制剂PD0325901选择性地抹掉BNLF2b和PKIA的适应度优势，不影响E7。AF3截去无序段后给出BNLF2b–PKA复合物（ipTM=0.79），BNLF2b坐进底物裂缝，带着模仿PKIA/PRKAR1A的RRNAL伪底物基序（对应RRXAI）和一段脯氨酸富集辅助基序。丙氨酸/赖氨酸扫描和定点突变两边一拆，结合和促生长一起垮。但PKIA做不出软琼脂克隆，PKA结合缺陷的BNLF2b突变体还留一部分锚定非依赖生长。RNA-seq给出第二条臂：细胞外基质和上皮间质转化基因（RUNX2、COL1A1、FN1等）上调，失巢凋亡相关基因下调。论文把这叫模仿加码：一边学宿主激酶抑制剂激活MAPK，一边另开转化程序。
这张图把「未注释短ORF大多是噪声」这个默认假设打穿了：二次筛2028个命中里七成没注释，Perturb-seq里强转录表型的75%同样是未注释或几乎没功能注释。对做病毒学和蛋白设计的人，短线性基序加跨膜螺旋这种分子钥匙是可迁移的零件；Rae1和TAP被远缘病毒反复瞄准，像是宿主网上的薄弱点。
BNLF2b把临床观察接上了机制。抗BNLF2b抗体本来就是鼻咽癌筛查标志物，功能一直空着。上皮细胞里它走PKA–MAPK，给MAPK靶向药进EBV相关上皮癌提供了一个实验理由，还没有在肿瘤模型里验证。Perturb-seq规模化之后，整张泛病毒蛋白组可以按功能而不是按序列重排。虚拟细胞建模如果要非CRISPR扰动，病毒ORF是另一类把细胞推到新状态的工具。
这张图谱是低估。需要别的病毒辅因子才干活的微蛋白会被漏掉，EBV BDLF3.5就是例子：它在病毒前起始复合物里推晚期裂解基因，单独过表达哪张筛都打不中。促癌表型极度依赖细胞类型和培养基，K562几乎看不见促生长，换一套模型可能漏掉同类机制。漏斗入口是生长，MHC-I那40%无生长表型的命中已经说明入口本身在偏样本。
过表达本身也是坑：pTRE可能堆不到生理量，短而不稳定的肽会假阴性；反过来超量表达会造伪表型。他们用长度和物化性质匹配的阴性对照压背景，但不能替代感染情境。AF3对宿主–病毒复合物缺共进化信号，他们只用ipTM>0.75，大量真实界面可能被扔掉，留下来的也还是预测。Rae1和PKA的关键残基靠突变撑住了，其他分子钥匙多数没有同等验证。BNLF2b的肿瘤证据停在RPE-1和口腔角质细胞过表达，没有EBV感染的上皮转化模型，更没有患者组织里的因果数据。